Ciclo cellulare

La prima fase del controllo genetico del ciclo cellulare riguarda la transizione G0-G1 che è attivata da stimoli esterni. Attraverso diversi esperimenti si è visto che ci sono due fattori di crescita molto importanti che consentono l’entrata della cellula in fase G1. Il PDGF (Platered Derived Growth Factor) definito anche come fattore di competenza perchè permette alla cellula di entrare in fase G1 e il fattore di crescita IGF1 (Insulin Growth Factor 1) che viene definito come fattore di progressione, perchè permette alla cellula di progredire in fase G1 fino alla fase S, di entrare dunque nella fase S. Essi sono specifici per i fibroblasti ed utilizzano recettori tirosin-cinasici, in particolare attivando la via di trasduzione del segnale delle MAP chinasi, che convergono su questa pathway da entrambe le vie di questi recettori, per potenziare l’effetto biologico che in presenza di un solo fattore di crescita non permetterebbe alla cellula di avanzare nel ciclo cellulare, in quanto non avrebbe uno stimolo sufficientemente forte. È molto importante sottolineare dunque come ci sia bisogno a questo livello di cellule che agiscono dall’esterno per produrre questi fattori di crescita che permettono alla cellula di proseguire nel ciclo cellulare. Durante questa fase G1 i geni trascritti sono tantissimi, ad esempio tutti quelli che abbiamo citato in precedenza, in particolare i cosiddetti geni housekeeping che svolgono una funzione per lo più strutturale a livello della cellula, ma anche geni ciclo-relati che mi permettono di avanzare in G1 e che sono rappresentati dai geni c-MYC, c-FOS, il gene per la proteina P53, la vimentina, la calciclina, la ADP-ATP traslocasi e numerose altre proteine, che si accompagnano anche all’aumento dimensionale della cellula. Come faccio però a distinguere i geni housekeeping da quelli ciclo-relati? È molto semplice, attraverso esperimenti di inattivazione genica posso utilizzare RNA antisenso o micro-RNA che si vanno a legare al RNA messaggero della proteina inattivando la sua traduzione e portandola a degradazione attaverso la ribonucleasi III che è un enzima che degrada le molecole di RNA a doppia catena, a questo livello sono anche in grado con questo legame di inattivare il loro legame ai ribosomi, ma anche attraverso anticorpi specifici posso andare a legare direttamente la proteina, e si è visto che se vado a bloccare la funzione dei geni ciclo-relati (a loro volta stimolati dai fattori di crescita esogeni citati in precedenza) la cellula non riesce a progredire in fase G1. Ad esempio queste sequenze di RNA le faccio entrare nella cellula attraverso la formazione di buchi sulla membrana cellulare che vado ad indurre con stimoli di corrente elettrica, e una volta bloccato ad esempio l’mRNA di c-MYC, blocco la formazione della proteina e qui le cellule si bloccano totalmente in G1. Ho così tolto un fattore trascrizionale importante per entrare nella fase S, ma lo sono anche c-FOS, e c-JUN. Posso fare anche esperimenti di overespressione di un gene, come nel caso di c-MYC, e posso notare come le cellule siano andate incontro a un processo di immortalizzazione, in quanto sono in grado di proliferare e basta, le sue pathways sono messe in secondo piano dalla via di proliferazione cellulare, così la cellula non può più tornare in fase G0, non può andare incontro al differenziamento e nemmeno al processo di apoptosi.

A questo punto arriviamo al primo punto di restrizione, ovvero al primo punto di checkpoint a controllo endogeno: ora ci chiediamo quali siano stati gli esperimenti che hanno portato alla scoperta di questo meccanismo, e abbiamo visto che hanno interagito a questo livello esperimenti di fusione cellulare, studi su degli ovociti di rana e successivi studi sui lieviti per capire cosa effettivamente controlla questi checkpoints di regolazione. Nell’esperimento di FUSIONE CELLULARE vediamo che fondere due cellule tra di loro è molto semplice, perché basta prendere un collante cellulare, che si chiama PEG (polietilenglicole). Se prendo due cellule in presenza di polietilenglicole osservo la fusione delle membrane citoplasmatiche esterne e mi trovo una cellula con due nuclei, che al microscopio riesco a riconoscere bene. Ho diverse possibilità di incastro perché posso fondere una cellula in G1 con una cellula in G2, una cellula in S con una cellula in G1, una cellula in S con una cellula in G2, una cellula in M con una cellula che si trova in una di tutte le altre fasi del ciclo (G1, S o G2). Ma cosa succede in tutti questi esperimenti? Fondendo una cellula in G2 con una cellula in S non succede assolutamente nulla, perché i due nuclei rimangono così come sono, anche dalla fusione di una cellula in G1 con una cellula in S non ottengo risultati significativi, al limite un’accelerazione della cellula in S, ma nulla di più, e la stessa cosa vale per la fusione di una cellula in G2 con una cellula in G1, però tutte le volte che fondo una cellula in M con una cellula in G1 o in S o in G2, nel nucleo della cellula che prima era in interfase vedo comparire i cromosomi ed è una cosa incredibile, perché una cellula in interfase (ovvero in G1, S o G2) in cui compaiono i cromosomi è assolutamente anomala, dato che normalmente ha la cromatina più dispersa e non condensata. Allora è stata ipotizzata l’esistenza di un fattore, che è stato chiamato MPF, ovvero “Mitosis Promoting Factor”, anche se in realtà non promuove la mitosi, perché una cellula in G1 non va in mitosi, ma condensa semplicemente la cromatina. Questa è stata una prima osservazione attraverso questi primi esperimenti. Negli ESPERIMENTI DI MICROINIEZIONE IN OVOCITI DI RANOCCHIO, si prendono degli ovociti di rana, isolati e non fecondati, quindi fermi nella profase I meiotica, e vi si inietta, con un sistema di microiniezione, cioè facendo una micropuntura alla cellula con un minimo di pressione, quello che si desidera, in questo caso degli estratti di cellule o in mitosi o in interfase. Quando microinietto un estratto di cellule in interfase, non succede assolutamente niente, ma se invece inietto un estratto di cellule in fase mitotica, la meiosi dell’ovocita va avanti e si forma il fuso mitotico, e quindi la cellula tende a proseguire verso la seconda fase della meiosi. Anche in questo caso si ha un MPF (la sigla è rimasta la stessa, ma con l’accezione di “Maturation Promoting Factor” perchè promuove la meiosi degli ovociti) e su questo dato ci si è fermati per tanti anni, perché si è cercato di purificare questo fattore con diverse metodiche, ma nessuno ha capito che cosa fosse realmente. L’unica cosa che si è capita è che questo MPF si forma solamente alla fine della fase G2, perché la sua attività compare alla fine di questa fase e scompare al termine della fase M, ha quindi un’attività transiente, poiché funziona solo nella transizione G2-M. Ci sono stati diversi tentativi biochimici per caratterizzare questo MPF, ma sono stati del tutto infruttuosi, fino a che Paul Nurse, che tra l’altro ha preso il premio Nobel per la medicina per questi ESPERIMENTI, ha lavorato SUL ciclo cellulare del LIEVITO, in particolare di due ceppi, ovvero gli Schizosaccharomyces Pombe (si replicano per divisione simmetrica, da cui originano due cellule figlie uguali tra loro, che possono essere due cellule staminali, oppure due cellule differenzianti) e i Saccharomyces Cerevisiae (che si replicano per gemmazione), che hanno due modalità di divisione leggermente diverse, ma hanno comunque tutte le fasi del ciclo cellulare, ovvero G1, S, G2 e M, quindi hanno un ciclo proliferativo molto simile agli eucarioti superiori. Il tentativo che si fa è quello di capire come viene regolato questo processo e come viene svolto negli organismi più semplici, come appunto il lievito, che rappresenta l’organismo che ha dato i risultati migliori in termini di analogie con i meccanismi che regolano gli eucarioti superiori. Questo lo dobbiamo in particolare al fatto che da questo tipo di organismi possono originarsi i mutanti temperatura-sensibili, infatti se porto la temperatura da 25 a 35 gradi °C il lievito si duplica con un corredo genetico aploide (quindi avremo un ciclo aploide-diploide-aploide) mentre precedentemente il corredo genetico era diploide (il ciclo era rappresentato da un alternanza di fasi diploide-tetraploide-diploide). Questo vuole dire che io se attivo il ciclo di microsporulazione (ovvero di genesi delle spore) per porre in condizioni di stress l’organismo del lievito, ottengo come risposta un organismo che possiede ora un solo allele genico, cioè una copia di un gene funzionante e se io faccio esperimenti di mutagenesi, quindi metto delle sostanze mutagene a contatto con il lievito, che sono in grado di indurre una mutazione puntiforme ad ogni ciclo replicativo del lievito, che avviene circa ogni 45 minuti, con una mutazione nei geni giusti posso ottenere una situazione in cui la colonia sarebbe cresciuta e proliferata a 25 gradi °C di temperatura, ma quando porto la temperatura a 35 gradi °C essa non prolifera più, il che vuol dire che ho interferito su un qualche gene che era importante per la proliferazione cellulare, ed ora non sono più quindi in grado di far crescere la mia colonia di lievito. Per trovare questi geni facciamo solitamente degli esperimenti di complementazione: uso delle librerie di cDNA, ovvero DNA formato a partire dalla copia matura di RNA messaggeri attraverso l’azione dell’enzima trascrittasi inversa, poi costruisco un “cDNA double stranded” usando la DNA polimerasi e alla fine ottengo una copia a doppio filamento di tutti gli RNA del lievito, che vado ad inserire ognuno in un plasmide, poi ogni plasmide lo inserisco in una cellula diversa attraverso il processo di transfezione (generica procedura di inserzione di materiale genetico (DNA) all’interno delle cellule al fine di poter curare delle patologie) e guardo quale cellula ha corretto il difetto andando a sintetizzare la proteina che abbiamo inserito con il plasmide. Però abbiamo detto che ho un milione di ricombinanti, e allora come opero questo tipo di passaggio? Opero per diluizione della libreria, ovvero se ho un milione di ricombinanti faccio 10 gruppi e in ciascuno controllo 100’000 ricombinanti, successivamente guardo qual’è il pool di ricombinanti che mi corregge il difetto, lo seleziono, lo amplifico e faccio un ulteriore diluizione, da 100’000 a 10’000 ricombinanti, e operando così per diluizione vado a discriminare un singolo plasmide che porta un singolo cDNA che codifica per la proteina giusta che corregge il difetto, quindi posso sapere qual’è quel gene facendo il sequenziamento del cDNA che controlla quella particolare caratteristica che stiamo studiando, e vado a controllare se è presente nelle banche dati, ovvero se è già stato catalogato come gene.

Quelli fatti da Paul Nurse erano dunque esperimenti simili in cui venivano trovati mutanti isolati nelle varie fasi del ciclo, ad esempio sono stati trovati diversi mutanti G1, che bloccano la cellula nella fase G1 del ciclo, inoltre sono stati trovati dei mutanti che riescono a bloccare il lievito anche nelle altre fasi del ciclo, quelle successive. Con questi esperimenti sono uscite delle proteine che prima erano sconosciute, delle piccole chinasi che nel lievito sono state chiamate con la sigla CDC (Cell Division Cycle), seguite poi da un numero che le identificava a seconda del tipo di lievito in cui erano state trovate. Queste sono serin-treonin chinasi che funzionavano nel lievito ma nessuno era al corrente se fossero presenti anche nell’uomo, per guardare questo si è usata così la tecnica di immunoprecipitazione, cioè si sono sviluppati anticorpi specifici che riconoscevano queste specifiche chinasi anche all’interno di cellule umane. Questa tecnica è stata produttiva e le chinasi sono state trovate anche nell’uomo e chiamate CDK (Cyclin Dependent Kinases), ovvero chinasi associate a specifiche molecole chiamate cicline, molecole chiamate cosi perché hanno un andamento ciclico, infatti sono quelle proteine che sono espresse in alcune fasi cellulari e che poi sono rapidamente degradate, ad esempio citiamo le cicline D, C, E, A e B1 (l’andamento ciclico di queste cicline è dovuto al fatto che queste proteine compaiono e poi vengono degradate in continuazione). Se guardo invece il comportamento delle chinasi associate a queste cicline, noto che è completamente diverso, perché le chinasi sono sempre espresse in tutte le fasi del ciclo cellulare. Non sono uscite le cicline (molecole specifiche che formano eterodimeri con le CDK) da esperimenti di mutagenesi, ma sono state scoperte successivamente con diversi esperimenti. Queste molecole rendono conto del fatto che le CDK sono espresse per tutta la durata del ciclo cellulare, mentre le cicline sono espresse in particolari momenti dello stesso ciclo cellulare, entrambe queste famiglie appartengono a famiglie multigeniche e rappresentano due categorie di proteine molto importanti che regolano il decorso della cellula stessa a livello del ciclo cellulare.