Cicline e ciclo cellulare

I checkpoints di controllo del ciclo cellulare sono 2: uno è rappresentato dalla transizione G1-S (il controllo della transizione G1-S è complicato per la quantità di proteine che vi entrano in gioco), mentre l’altro è rappresentato dalla transizione G2-M. Abbiamo detto inoltre che questo è un controllo endogeno, ovvero che i geni per avanzare in queste tappe del ciclo cellulare sono trascritti dalla cellula stessa, che non subisce condizionamenti dall’esterno per attivare (ulteriormente) questi geni. I fattori che entrano in gioco in questi tipi di checkpoint sono le chinasi ciclina-dipendenti (CDK), le cicline che si associano alle CDK, alcuni geni chiamati oncosopressori, tra cui citiamo RB e P53, ed entrano in gioco anche dei fattori trascrizionali come E2F. L’andamento ciclico delle fasi del ciclo cellulare (dall’immagine sulla regolazione del ciclo cellulare possiamo notare il caratteristico andamento ad onda dovuto all’alternarsi delle fasi del ciclo) è dovuto al fatto che abbiamo cicline diverse per le varie fasi che si alternano da un punto di vista della loro presenza, della loro concentrazione, infatti possiamo distinguere delle cicline in G1 che sono le cicline D che si uniscono alle CDK4 e alle CDK1, mentre le cicline E agiscono principalmente con le CDK1, nella fase S abbiamo invece le cicline A che interagiscono sempre con le CDK1, ed infine nella transizione G2-M continuano a funzionare le cicline A ma sono prevalenti le cicline B, e lavorano con le vecchie CDK1, ricatalogate dopo il Progetto Genoma Umano.

Ma perchè soltanto le cicline vanno incontro ad un processo di degradazione? Abbiamo detto che una ciclina e una CDK formano un eterodimero, quindi hanno la capacità di interagire fra loro, ma si dice anche che le cicline fanno parte di un’unica famiglia funzionale perché hanno una struttura uniforme, infatti hanno una particolare sequenza che si chiama “cycline box”, una sequenza amminoacidica che è conservata in tutte le cicline. Infatti se andiamo a controllare l’estremità N-terminale o l’estremità C-terminale della proteina ci rendiamo conto che ci sono delle sequenze particolari, ad esempio all’estremità C-terminale abbiamo la sequenza PEST (acronimo di amminoacidi) formata in ordine da prolina, glutammato, serina e treonina (in particolare delle cicline E, C e D), mentre all’N-terminale delle cicline A e B abbiamo una sequenza amminoacidica analoga dal punto di vista funzionale, e queste due sequenze appena descritte possiamo vederle come delle sequenze di ubiquitinazione, che legano ubiquitina attraverso un meccanismo post-traduzionale e vanno quindi incontro al processo di poliubiquitinazione, noi sappiamo che una proteina poliubiquitinata viene infatti degradata proprio perchè attraverso questo meccanismo viene riconosciuta dal proteasoma e viene qui idrolizzata. Possiamo osservare nell’immagine il meccanismo di poliubiquitinazione relativo alla sequenza N-terminale delle cicline A e B, in particolare vediamo che il sistema di attacco delle molecole di ubiquitina è proprio su questa regione, che determina la veicolazione della proteina al proteasoma. Quando la ciclina è fosforilata protegge queste regioni, come vedremo dopo, mentre quando è defosforilata ovviamente la ciclina torna in conformazione “open” (chiamata anche conformazione normale) e viene attaccata dall’ubiquitina.

Come fa ad essere stabilizzato il complesso CDK-ciclina? Quando la CDK non è impegnata a formare l’eterodimero con la ciclina, ha due siti di fosforilazione, in particolare uno in serina e uno in treonina: un sito però è inibitorio e per far interagire la CDK con la ciclina, bisogna che il sito inibitorio venga defosforilato attraverso una fosfatasi specifica, quindi quando questo enzima è attivato fa due cose, ovvero si associa alla ciclina e forma l’eterodimero, poi la CDK essendo una chinasi fosforila la ciclina stessa in serina. Questo permette il cambiamento del “folding” della proteina, in questo modo l’N-terminale e il C-terminale vengono portati all’interno dell’eterodimero e non sono più attaccabili dal sistema di poliubiquitazione, mentre quando si forma questo eterodimero, che a questo punto è attivo, vuole dire che la cinasi è parzialmente defosforilata, e questo serve per avere in forma attiva il dominio catalitico, a questo punto l’eterodimero stabile è in grado di andare a fosforilare una serie di proteine bersaglio.

I substrati proteici che vengono fosforilati da questo complesso eterodimerico non sono ancora completamente noti ma si sa per certo però, che se le proteine vengono fosforilate diventano attive, ad esempio possiamo citare la timidilato sintasi o la timidilato chinasi, in questa fase quindi la fosforilazione delle proteine le rende attive e rende attivo in definitiva tutto l’apparato di duplicazione del DNA. Le cicline associate alle chinasi sono quindi il sistema che permette alla cellula di superare il checkpoint, cioè favoriscono il passaggio dalla fase G1 alla fase S preparando la cellula con la fosforilazione di centinaia o migliaia di proteine che alla fine permettono che il DNA venga duplicato. Questa importanza delle cicline la posso soprattutto notare se faccio degli esperimenti andando a bloccare la trascrizione ad esempio delle cicline D o delle cicline E, in questo modo la cellula non duplica più il suo DNA e si blocca nella fase G1 (questo blocco lo posso notare ad esempio attraverso delle immunofluorescenze, infatti posso vedere che queste proteine non entrano più nel nucleo a svolgere la loro funzione). Quando però la cellula ha fosforilato tutte le proteine che servono per la duplicazione del DNA, il complesso si disattiva perché la ciclina viene defosforilata e degradata dal sistema di poliubiquitinazione mentre la chinasi viene fosforilata sul sito inibitorio e rimane stabile.

Come abbiamo già detto questo è il motivo per cui le cicline hanno un andamento ciclico, esse infatti vengono sintetizzate, poi vanno a svolgere il loro effetto biologico e infine vengono degradate, mentre le chinasi rimangono ad una concentrazione cellulare costante sia che siano monofosforilate o che siano bifosforilate, infatti il loro livello di fosforilazione serve solo per attivare il sito catalitico, inibendo il sito di inibizione nel momento in cui andiamo a fosforilarlo.

Per quanto riguarda la regolazione della progressione cellulare attraverso questi checkpoints, entrano in gioco anche altre proteine, ad esempio parliamo degli inibitori delle chinasi chiamati CDK I. In particolare descriviamo due famiglie, che sono rappresentate dalla “INK family” che è formata da piccole proteine chiamate P15, P16, P18 e P19, mentre la famiglia KIP/CIP è formata da altre piccole proteine come P21, P27 e P57. Tutte queste proteine che possono essere prodotte dalla cellula si legano al complesso attivo ciclina-chinasi, formano un eterotrimero e il complesso viene disattivato, non fosforilando più substrati proteici. Un esempio di questo meccanismo è l’inibizione da contatto, abbiamo infatti visto che i fibroblasti crescono in coltura ma quando sono a confluenza, cioè arrivano a far adesione l’uno con l’altro, si bloccano nella fase G1. In effetti se andiamo ad analizzare bene la situazione, vediamo che iniziano a produrre una citochina, la TGF-β, che attraverso una via di trasduzione del segnale particolare che passa attraverso una famiglia di proteine chiamate SMAD, induce la trascrizione della proteina P27. La P27, come gia detto, fa parte della famiglia KIP/CIP degli inibitori delle cinasi e si lega al complesso ciclina-chinasi bloccandone l’attività di fosforilazione. La stessa cosa vale per la P21, che è indotta da un gene oncosoppressore che codifica per una proteina importante che è la proteina P53: anche in questo caso la P21 si lega al complesso CDK-ciclina e ne blocca l’attività fosforilativa. Tutto questo è finalizzato ad avere nella transizione G1-S dei risultati diversi a seconda dei “players” che entrano in gioco: se entrano in gioco solo le cicline e le cinasi il tutto procede verso la fase S ma se prevalgono altri effetti sulla cellula, vengono prodotti gli inibitori delle CDK e si blocca la cellula nella fase G1.

 

Il complesso MPF l’avevamo visto precedentemente nel lievito e si è visto che ha un andamento ciclico come le cicline, infatti compare prima della fase mitotica e viene degradato alla fine della stessa fase mitotica. Esso ha diverse funzioni a livello del processo mitotico, infatti determina la frammentazione della membrana nucleare, la condensazione cromosomica, interviene anche sulla defosforilazione delle catene leggere della miosina e favorisce la formazione del fuso mitotico, alla fine però la degradazione della ciclina che rientra in questa struttura porta al non funzionamento delll’MPF, infatti esso è formato da un eterodimero CDK1-ciclina B1. Se andiamo ad analizzare il meccanismo di attivazione di questo complesso MPF, avevamo detto che la chinasi ha due siti di fosforilazione di cui uno sulla regione inibitoria, e quando questa regione viene defosforilata si attiva la chinasi che si lega alla ciclina B1 che viene fosforilata e quindi alla fine si forma il complesso attivo MPF. Alla fine della fase M la ciclina viene defosforilata, viene attaccata dall’ubiquitina e quindi viene degradata mentre la chinasi viene fosforilata sul sito inibitorio. Tra le proteine (ce ne sono a centinaia) che vengono fosforilate per favorire l’avanzamento sul checkpoint cellulare della fase G2-M, vediamo che ci sono le lamine nucleari, ovvero dei filamenti intermedi che si trovano all’interno del nucleo, al di sotto della membrana nucleare interna, e cosituiscono l’aggancio tramite una serie di proteine al DNA e dunque all’intera struttura della cromatina da una parte, e alla struttura proteica della membrana nucleare (che a sua volta media un aggancio proteico con le strutture citoscheletriche del citoplasma) dall’altra parte. La fosforilazione delle lamine nucleari è un evento importante perché se fosforilate determinano una frammentazione della membrana nucleare, essa infatti quando non è più legata da questa rete formata dalle lamine A, B e C tende a frammentarsi perchè perde il suo sostegno strutturale più importante. Con la scomparsa della lamina nucleare abbiamo così la continuità fra il compartimento citosolico e il compartimento nucleare, questo fatto è molto importante infatti perché i microtubuli, nell’assemblamento del fuso mitotico, si devono assemblare sia a livello della membrana cellulare che ai cinetocori dei cromosomi. Questi microtubuli per polimerizzazione crescono dal centriolo verso l’interno della cellula, arrivano poi fino ad attaccarsi ai cromosomi e favoriscono l’allineamento dei cromosomi e la formazione del fuso mitotico sulla linea equatoriale, e questi sono i microtubuli del cinetocore, mentre i microtubuli polari si dirigono dal polo cellulare verso il centro del fuso, così la divisione dei cromosomi che sono allineati sulla linea equatoriale avviene sia per la depolimerizzazione dei microtubuli che legano i cinetocori dei cromosomi, che per lo scorrimento l’uno sull’altro dei microtubuli polari che permette l’allontanamento dei due poli della cellula, contenenti i due centrosomi (struttura formata dall’insieme dei due centrioli). L’altro evento importante a questo livello è la condensazione della cromatina, si devono infatti formare i cromosomi e nella fase iniziale la condensazione della cromatina è legata all’istone H1 che si trova tra i nucleosomi, dunque la fosforilazione dell’istone H1 che prima ha una struttura aperta, permette la chiusura della struttura e compatta i nucleosomi, questo è uno dei primi eventi di condensazione della cromatina. Successivamente il complesso MPF inteviene anche nella defosforilazione della catena leggera della miosina che determina la possibilità che questa proteina contrattile possa andare incontro alla contrazione, questo infatti è molto importante per la formazione dell’anello contrattile della citodieresi, che determina la separazione finale delle due cellule. Poi ovviamente alla fine della mitosi il complesso ciclina-chinasi diminuisce fortemente la sua concentrazione e quindi il complesso MPF viene inibito da un punto di vista funzionale, attraverso i soliti meccanismi che abbiamo detto prima vanno ad inibire i complessi CDK-ciclina.

Se riprendiamo tutta la logica di tutto il controllo genetico del ciclo cellulare, diciamo che nella transizione G0-G1 avviene, come nel modello dei fibroblasti che avevamo preso precedentemente in cosiderazione, il passaggio da una cellula quiescente (in G0, con un basso metabolismo ed un’alta sopravvivenza) a una cellula attiva, che gli permette l’entrata nel ciclo cellulare, ovvero nella fase G1. Tutto questo è permesso grazie a dei fattori esterni alla cellula, ad esempio a specifici fattori di crescita, ed in particolare per i fibroblasti abbiamo che il PDGF1 che con il suo recettore comporta l’attivazione della via mitogenica classica mediata da un recettore tirosin-chinasico. Però questo fa entrare la cellula in G1 (la fase del ciclo cellulare che dura di più, circa 14 ore) ma non permette di fare la progressione nella fase G1, nei fibroblasti questa progressione avviene con il fattore di crescita IGF1 e quindi con l’induzione della via mitogenica mediata da un recettore tirosin-cinasico che passa da RAS e dai fattori trascrizionali c-JUN e c-FOS. In questa maniera abbiamo un certo sinergismo tra questa via mitogenica classica e tra una serie di geni che si attivano nella fase G1, che sono i geni ciclo-relati, funzionanti nella fase G1 e nella fase S (nel G1 tardivo andiamo infatti ad attivare precocemente i geni che dovranno funzionare nella fase S). Con esperimenti di iperespressione (questi esperimenti possono portare ad ottenere delle cellule immortalizzate) o inattivazione di questi geni abbiamo dimostrato (questi geni possiamo identificarli con c-MYC, c-FOS ed anche altri fattori trascrizionali) che essi sono fondamentali per questa fase di progressione, e queste prime azioni che abbiamo descritto avvengono per stimoli microambientali esterni dati dalla PDGF1 e dalla IGF1. Se arriviamo ora in prossimità del punto di restrizione o del punto di non ritorno dove c’è la transizione G1-S, regolata dalle cicline D ed E con le corrispondenti chinasi (che in questo caso sono le CDK1), vediamo che questo è un controllo positivo perché se il complesso si attiva, avviene la fosforilazione di proteine importanti per la duplicazione del DNA e si favorisce il passaggio dalla fase G1 alla fase S, anche se ci sono due categorie di geni che giocano contro questo passaggio che sono il gene per la proteina P53, il gene per la proteina RB (fanno parte della categoria dei geni oncosoppressori) e i geni per le proteine CDK I (queste CDK I comunque non sono prodotte solamente sotto stimolo della proteina P53 ma anche da altri fattori di crescita come il TGF-β e molte altre proteine). Qui abbiamo quindi una competizione reale, infatti il complesso attivo ciclina-cinasi deve andare a fosforilare la proteina RB per non farla interferire con il progresso della cellula nel ciclo cellulare, perchè se RB è defosforilata può competere direttamente con le cicline D o con le proteine prodotte dai geni ciclo-relati nella progressione della fase G1 (che distinguiamo in un G1 precoce, un G1 medio ed un G1 tardivo), mentre la proteina P53 attraverso l’induzione della P21 blocca in G1 il ciclo cellulare, mentre ci sono i vari CDK I che vanno a bloccare il complesso attivo ciclina-CDK. Questo lo abbiamo definito il primo checkpoint endogeno di controllo del ciclo cellulare, poi c’è la fase S che di solito va abbastanza in automatico, abbiamo visto che qua è importante il fattore E2F perché induce come fattore di trascrizione proteine importanti per la duplicazione del DNA, però se succede qualcosa da un punto di vista degli “errori di missmatch” interviene sempre il gene oncosoppressore P53 che funziona da sensore per questi errori, si rende conto se c’è una disfunzione nell’appaiamento di basi e attraverso la proteina P21 può bloccare la cellula in fase S per permettere ai meccanismi di riparazione cellulare di tagliare il DNA e rimetterlo a posto. L’apoptosi è possibile anche nella fase S perché se i danni non vengono riparati e il DNA si sta duplicando non c’è alternativa, per evitare che si trasmettano numerose mutazioni la proteina P53 agisce andando ad attivare indirettamente diversi geni proapoptotici. Dopo arriviamo alla fase G2, una importante fase di transizione a cui segue il secondo checkpoint cellulare, ovvero la fase di transizione G2-M. Questa transizione è portata avanti dalla ciclina B1 e dalla cinasi CDK1: si forma infatti il complesso attivo MPF che permette la fosforilazione delle lamine nucleari, degli istoni H1, la defosforilazione con una fosfatasi della catena leggera della miosina che permette la formazione dell’anello contrattile, infine abbiamo la degradazione del complesso che ne permette la disattivazione funzionale. Una situazione particolare che può accadere in mitosi è la catastrofe mitotica in cui non si separano i cromosomi e in cui non si riesce a fare il fuso mitotico: il destino della cellula in questi casi è sicuramente quello di morte cellulare.

Se la cellula non riesce a superare il primo checkpoint di controllo perché prevale la proteina RB, o prevale la proteina P53 o l’effetto delle CDK I, questa cellula in G1 può andare in apoptosi grazie all’effetto indiretto della proteina P53 che può indurre diversi geni proapoptotici a svolgere la loro funzione, oppure permette alla cellula di andare in differenziamento, oppure di andare in progressione inversa e tornare a innicchiarsi nella fase di quiescenza, quindi se c’è un blocco nella fase G1 la cellula ha parecchie alternative. Il problema è invece se la cellula è bloccata nella fase G2 perché non riesce a superare il secondo checkpoint di controllo, infatti a questo punto l’unica alternativa possibile è l’apoptosi, perché la cellula ha già duplicato il suo DNA, quindi avendo un contenuto tetraploide non può permettersi di differenziarsi o di tornare in quiescenza, essendo troppo alterata dal punto di vista della quantità del DNA per poter svolgere un qualsiasi effetto biologico in maniera naturale. Invece nella fase M può malfunzionare il distacco dei cromatidi, si va dunque verso una catastrofe mitotica e poichè il DNA è già stato duplicato, l’unico destino possibile è sempre l’apoptosi.