Cellule tumorali

L’insorgenza di tumori è legata allo sviluppo di numerose alterazioni genetiche molto diverse le une dalle altre che inducono l’alterazione dell’equilibrio alla base dell’omeostasi di un tessuto. Bisogna sottolineare che non sempre alla base di un tumore vi è un fenomeno di elevata attività proliferativa, lo sviluppo tumorale può essere legato anche ad altri fattori come il blocco del differenziamento, ad esempio quando il blocco del differenziamento che causa il tumore è legato ad una mancata attivazione del programma di apoptosi si può ricorrere al tentativo di mandare in apoptosi le cellule tumorali. Attualmente il trattamento dei tumori prevede il ricorso alla chemioterapia che spesso comporta gravi effetti collaterali per il paziente poiché elimina anche le cellule normali, oltre alle cellule tumorali, ma in molti casi purtroppo questo è l’unico sistema terapeutico funzionante. Tra i tumori più diffusi vi è il cancro al colon retto ma la sopravvivenza del paziente a tre anni è appena del 5 %, ciò significa che tutta la strategia in termini tumorali deve essere preventiva, in quanto occorre diagnosticare presto il tumore (quando è ancora di piccole dimensioni e ha una scarsa diffusione) e intervenire chirurgicamente per rimuoverlo prima che si estenda in altre regioni del corpo. Affinchè insorga un tumore occorrono parecchie modificazioni genetiche e la difficoltà della diagnosi precoce riguarda il fatto che il tumore nel suo stadio iniziale è silente (non dà sintomi particolari) finchè non raggiunge una massa tale per cui iniziano a comparire i primi sintomi clinici. Alla luce di quanto detto si tende a monitorare più frequentemente i casi più a rischio mentre quelli più sporadici risultano ancora più difficili da controllare.

Per capire gli “step” che si susseguono quando insorge un tumore si può prendere in considerazione il tessuto epiteliale: l’epitelio poggia su una menbrana basale e la crescita del tessuto in condizioni normali risulta estremamente regolare e organizzata poiché si ha un’ordinata proliferazione delle cellule staminali basali le cui cellule figlie vanno incontro a differenziamento e, man mano procedono verso la superficie, in corrispondenza della quale muoiono lentamente e si sfaldano. L’epitelio è un tessuto ad alta capacità rigenerativa che si ricambia ogni 21 giorni, ma quando si altera questo equilibrio si ha uno stato di displasia, che non indica ancora la presenza di un tumore ma un cambiamento dell’organizzazione del tessuto legato a una presenza maggiore di cellule proliferanti localizzate, non solo negli strati basali, ma anche in quelli più superficiali. Nonostante ciò le cellule sono in grado di differenziarsi e di andare in apoptosi, quindi nel caso della displasia si ha un ispessimento cutaneo. Nel tempo però l’iniziale displasia può diventare pericolosa e originare un carcinoma, ossia un completo sovvertimento della struttura del tessuto legato alla scomparsa di cellule differenzianti che sono state completamente sostituite da cellule proliferanti (si possono notare delle mitosi anche nello strato più superficiale dell’epidermide), questa anomalia è il cosiddetto tumore. Molti tumori cutanei sono facilmente aggredibili perché il tumore tende e svilupparsi verso l’esterno ma spesso ulteriori alterazioni genetiche fanno sì che queste cellule si organizzino per interrompere la continuità della membrana basale, infatti le cellule tumorali secernono degli enzimi proteolitici tipo l’urochinasi, in grado di digerire le componenti della matrice extracellulare, aprono un varco nella memrana basale e si infiltrano nel tessuto sottocutaneo. Una volta raggiunto il tessuto sottocutaneo la situazione inizia a diventare pericolosa perché le cellule tumorali iniziano ad aggredire l’endotelio dei vasi presenti in questo tessuto ed entrano in circolo. In tal modo entrano nel circolo periferico (questo rischio è particolarmente alto in seguito degli interventi chirurgici) e raggiungono i vari tessuti provocando numerose metastasi. Questo accade perché nuove alterazioni genetiche hanno portato le cellule in questione a slegarsi da qualsiasi controllo microambientale e a raggiungere un grado di autonomia tale da non rispondere più ad alcun controllo, favorendone così la crescita e la proliferazione in microambienti molto diversi da quello di provenienza. In termini di popolazione sono cellule che hanno dei vantaggi notevolissimi che permettono loro di colonizzare qualsiasi distretto, pur avendo alcuni cosiddetti ‘territori d’attacco’ preferenziali in cui metastatizzano più frequentemente. Queste cellule sostanzialmente hanno dei meccanismi che sono molto diversi da quelli delle cellule normali, ed il tutto è legato a molteplici alterazioni genetiche contemporanee le une alle altre.

Il comportamento delle cellule tumorali è stato studiato tramite appositi terreni di coltura trattati con nutrienti nei quali si è potuto osservare che, mentre le cellule normali si dividono per 30-50 volte, dopodichè entrano in una ‘fase di crisi’ e muoiono, quelle tumorali sono cellule “Growth Factor Indipendent” poiché sono in grado di crescere autonomamente anche in assenza di stimoli e nutrienti e una volta riempita la piastra di coltura iniziano a proliferare in multistrato creando dei cosiddetti ‘foci di trasformazione’, che hanno perso qualsiasi inibizione da contatto. Queste cellule vanno incontro a un fenomeno di ‘immortalizzazione’ che le rende completamente autonome dal microambiente circostante grazie alla presenza di meccanismi in grado di bypassare i normali sistemi di controllo. Un tipico esempio è rappresentato dall’esistenza di una coltura di cellule tumorali prelevate circa 50 anni fa, nel 1960, da una paziente attualmente decessa le quali, a distanza di decenni, presentano ancora un’intensa attività proliferativa. Tale autonomia conferisce alle cellule tumorali un enorme vantaggio biologico che in assenza di interventi terapeutici consente loro di prevalicare sulle altre cellule normali dell’organismo fino a distruggerlo.

Andiamo ora ad analizzare un modello sperimentale che prende in considerazione come funzionano i virus tumorali a DNA, in particolare prendiamo come esempio il virus SV-40 (un virus specifico per le scimmie, ovvero infetta prevalentemente le scimmie e molto più difficilmente altre specie animali), che è un modello classico di tumorigenesi, ed inoltre facciamo l’esempio del polioma, che appartiene alla classe dei papoavirus.

Il genoma del virus SV40 è piuttosto interessante, vediamo come sia un tratto di DNA a doppio filamento, circolare e molto piccolo, proprio perchè è lungo solo 5400 nucleotidi. Esso produce cinque proteine diverse, in particolare abbiamo le proteine VP1, VP2, VP3, la proteina “grande T” e la proteina “piccolo T”, attraverso il meccanismo di splicing alternativo, combinando dunque varie porzioni del proprio genoma (nel polioma è presente anche la proteina “medio T”). I virus infettano quindi necessariamente la cellula ospite e ne utilizzano l’apparato biosintetico, perchè non sono in grado di produrre autonomamente le loro proteine, poi queste proteine vanno a costituire una vera e propria particella virale andando a disporsi nel doppio strato lipidico che riveste il virus, mentre all’interno è contenuto l’acido nucleico. Come faccio però a purificare e a concentrare questi virus? Si usano delle linee cellulari fortemente infettate da questi virus e che producono numerosi virioni, vado a prendere il sopranatante di queste colture cellulari e vado a concentrare il virus mediante un ultracentrifugazione, ora posso così andare ad operare su una coltura cellulare di fibroblasti di topo, in particolare li vado ad infettare con questo tipo di virus, che però essendo specie-specifico devo forzare la situazione per vedere succedere qualcosa. Dopo un pò vediamo che le cellule cambiano le loro modalità di crescita e la loro morfologia, in particolare nono sono più disposte in fasci, alcune cellule perdono la loro polarità, altre invece vanno a modificarsi diventando rotondeggianti. Se lascio andare avanti l’infezione, vedo come tutte le cellule fibroblastiche vanno a modificarsi secondo queste caratteristiche. Questo succede come abbiamo già detto in coltura e in vitro, si dice dunque che le cellule sono trasformate.

Cosa vuol dire che le cellule sono trasformate? Queste cellule hanno molto meno bisogno dei fattori di crescita, non hanno più la capacità d’inibizione da contatto, possono quindi crescere in multistrato e formare i cosiddetti foci di trasformazione, perdono la capacità di andare in apoptosi o in differenziamento cellulare perchè i loro programmi genetici sono totalmente sbilanciati, non riescono più a fare adesione sia con altre cellule che con la matrice extracellulare (le molecole sulla superficie di adesione, come le integrine, sono down-regolate), cambiano la loro forma, passando da una forma allungata a una forma rotondeggiante per il cambiamento della disposizione del citoscheletro interno, c’è un movimento importante sulla superficie delle proteine integrali di membrana ed aumenta il bisogno di glucosio di queste cellule per il loro metabolismo energetico. Queste cellule possono anche secernere delle sostanze che prima non erano in grado di secernere, come delle cose che prima non facevano, ad esempio delle proteasi (uro-chinasi o attivatori del palsminogeno, in modo da digerire la matrice cellulare) o il TGF-β. Possiamo vedere anche su queste cellule come ci siano delle alterazioni al DNA significative che portano ad una modificazione del programma genetico della cellula. Oltre alla trasformazione cellulare, le cellule possono anche acquisire una caratteristica indipendente da tutte quelle che abbiamo citato precedentemente, ovvero si dice che le cellule sono immortalizzate, in pratica si sviluppano nell’attività proliferativa perdendo la capacità di andare incontro al differenziamento cellulare e all’apoptosi.

Se però le cellule sono tumorigeniche, cosa rende queste cellule capaci di originare situazioni tumorali? Se andiamo ad analizzare le proteine di questo virus, vediamo subito come le proteine VP1, VP2 e VP3 sono innocue perchè sono proteine strutturali, conferiscono infatti la struttura caratteristica al virus SV-40, mentre rimangono le due proteine precoci, quelle prodotte subito dopo l’entrata del virus nella cellula ospite, ovvero le proteine “grande T” e “piccolo T”. Innanzitutto per analizzare queste proteine prendo il frammento genico di DNA che codifica per la proteina “grande T” e la inserisco in un plasmide, ovvero in un vettore di espressione. Successivamente vado ad operare una transfezione di questo plasmide in una coltura di fibroblasti di topo, e vado a far overesprimere questo gene. Queste cellule diventano immortalizzate, vanno solo incontro alla proliferazione senza seguire nessun altro programma cellulare. Se vado ad inoculare queste cellule nel sottocute di un topolino, vedo che non danno origine a nessun tumore, provocano solamente un’iperplasia. Andiamo allora ad analizzare il gene per il “piccolo T”, operiamo con lo stesso trattamento e vediamo che i fibroblasti di topo colpiti da questo virus diventano cellule trasformate. Se andiamo ad analizzare come si comportano queste cellule nel sottocute di un topolino, vediamo come non siamo nemmeno adesso di fronte ad una situazione tumorale. Questo ci fa capire dunque che il tumore è un processo multistep, solo se facciamo esprimere insieme gli ultimi due geni analizzati possiamo andare a creare una situazione tumorale: in pratica in questa situazione il DNA virale si è integrato nel genoma cellulare, ed ha continuato a coesprimere le proteine “grande T” e “piccolo T”. Questo è potuto capitare proprio perchè i geni virali sono rimasti integri dopo essersi inseriti nel genoma cellulare, un qualsiasi evento di ricombinazione a questo livello avrebbe portato alla modificazione di questi geni e la situazione tumorale non si sarebbe più sviluppata. Questi geni sono stati chiamati oncogeni, ed è importante sottolineare come ci sia stata una vera e propria cooperazione tra questi oncogeni, la contemporanea immortalizzazione e trasformazione cellulare, la loro coespressione porta alla nascita di una situazione tumorale, mentre questi due eventi distinti non sono tumorigenici. Se però lascio cellule immortalizzate o cellule trasformate per qualche tempo a crescere in coltura, possono dare origine ad una situazione tumorale in quanto vanno incontro a meccanismi d’instabilità genetica, i meccanismi di riparo del DNA non sono più sufficienti a riparare tutti i danni a cui stà andando incontro la cellula, così si può determinare facilmente una seconda mutazione che porta ad una situazione di tumorigenesi. Il modello dei virus tumorali a DNA ha così posto le basi dell’oncogenesi molecolare, l’immortalizzazione e la trasformazione cellulare sono i due eventi che devono sempre avvenire in una cellula tumorale, e questo è dovuto all’over-espressione di particolari geni.