Cellule Staminali

Le cellule staminali sono molto importanti dal punto di vista clinico perché hanno aperto la strada della medicina rigenerativa.
Una cellula staminale è una cellula indifferenziata derivante da un embrione o da un adulto che ha la capacità di riprodurre se stessa e quindi mantenersi in uno stato indifferenziato (self-renewal o autorinnovamento) per lunghi periodi di tempo, o, in alcuni casi, per tutta la vita dell’organismo, inoltre è in grado di differenziarsi in cellule più mature che successivamente si differenziano nelle cellule specializzate di tutti i tessuti dell’organismo.

Come fa la cellula staminale ad espletare queste due funzioni? Lo fa attraverso un particolare tipo di mitosi che prende il nome di divisione asimmetrica, attraverso la quale ogni cellula staminale è in grado di dare origine a due cellule figlie, geneticamente identiche, ma fenotipicamente diverse: una perfettamente identica alla cellula madre, anche morfologicamente (indifferenziata), mentre l’altra leggermente più differenziata della cellula staminale.
Nel primo caso, la cellula staminale esercita la sua proprietà di self-renewal, scongiurando la possibilità di esaurimento del pool di cellule staminali all’interno del tessuto, mentre nel secondo quella di differenziare a cellule più specializzate. Il differenziamento è un processo attraverso il quale una cellula indifferenziata (cellula staminale) modifica la propria espressione genica e, attraverso varie transizioni differenziative, acquisisce nuove caratteristiche morfologiche e funzionali, in relazione alle caratteristiche del tessuto di cui andrà a far parte.
La modificazione morfologica va di pari passo con l’acquisizione di nuove funzioni. La forma della cellula infatti ne rispecchia la funzione, in questo caso vediamo le cellule ciliate della coclea, che sono sensibili alle vibrazioni sonore grazie alle loro specializzazioni apicali. Le cellule staminali, al contrario hanno sempre una forma sferica.

Se infatti guardiamo la cellula staminale emopoietica, vediamo che essa dà origine a tutte le cellule del sangue, che sono gli eritrociti o globuli rossi, cellule di forma discoidale, mancanti del nucleo e del sistema membranoso citoplasmatico, che trasportano l’O2 nel sangue legato all’emoglobina. I leucociti o globuli bianchi sono cellule che ci proteggono dalle infezioni, in quanto possono transitare dal sangue ai tessuti nel sito di infezione. Si distinguono in linfociti (B e T), monociti/macrofagi e granulociti (neutrofili, eosinofili e basofili), mentre le piastrine partecipano al processo di coagulazione del sangue, e rappresentano frammenti citoplasmatici di megacarioblasto.

 

Staminali,Globuli bianchi,monociti,leucocitiLe principali classi di cellule staminali sono rappresentate dalle cellule staminali embrionali (Embryonic Stem Cell), definite come le cellule derivanti dall’embrione ai primi stadi dello sviluppo, la blastocisti.
In particolare, la cellula staminale embrionale deriva dalla massa interna della blastocisti allo stadio di pre-impianto nell’utero. Esistono anche le cellule staminali adulte, cellule indifferenziate che si ritrovano all’interno di un contesto tissutale specializzato, possiedono infatti la capacità di self-renewal per tutta la vita dell’organismo. Cellule staminali dell’adulto sono state ritrovate nel midollo osseo, nel sangue periferico, nel cervello, nella cornea, nella retina, nella polpa dentaria, nel fegato, nella pelle, nell’epitelio intestinale e nel pancreas. Dopo i primi ritrovamenti di cellule staminali nei vari tessuti, ormai si crede che ogni tessuto possieda la propria popolazione di cellule staminali.

Dal punto di vista terapeutico, gli sforzi ora in corso sono volti a sfruttare le potenzialità delle cellule staminali, costituite in gran parte dall’applicazione in medicina rigenerativa per curare delle malattie che fino a poco tempo fa non potevano essere curate. Alcune tecniche terapeutiche sono già ampiamente sfruttate, come il trapianto di cellule staminali emopoietiche, di cellule staminali epiteliali, mentre alcune altre sono ancora in via di sperimentazione, le quali spesso si devono scontrare con problematiche di tipo etico, in particolare per quanto riguarda le cellule staminali embrionali.


Dopo la nascita, le cellule staminali adulte risiedono in uno speciale microambiente chiamato “NICCHIA”, che varia in natura e in localizzazione in maniera dipendente del tessuto. In generale la nicchia è composta da cellule che circondano la cellula staminale, che creano un network di segnali per il suo supporto e quindi per l’omeostasi ed il riparo tissutale. Ad esempio la cellula staminale emopoietica è circondata dalle cellule della nicchia, che interagiscono con la cellula staminale stessa e regolano il suo differenziamento e il suo self-renewal.
La nicchia protegge le cellule staminali dall’esaurimento, e nello stesso tempo preserva l’organismo da una proliferazione eccessiva delle cellule staminali stesse. Le cellule della nicchia sono quelle che vanno a produrre i fattori di crescita: esercitano la loro azione sulle cellule staminali, regolandone la proliferazione e il self-renewal. La nicchia costituisce l’unità funzionale basale del tessuto, poiché integra i segnali che mediano la risposta delle cellule staminali alle necessità dell’organismo, ed è tipicamente costituita da un tipo cellulare diverso da quello staminale, come ad esempio gli osteoblasti nel midollo osseo e le cellule endoteliali nel cervello.

Le cellule di supporto sono sempre un tipo cellulare diverso da quello staminale, ad esempio, in vari tipi di nicchia staminale emopoietica sono presenti vari tipi di cellule di supporto come gli osteoblasti (nicchia che favorisce il self-renewal), o gli adipociti che hanno un ruolo importantissimo per la caratterizzazione delle proprietà delle cellule emopoietiche. Nel sistema nervoso sono stati identificati diversi tipi di nicchie, uno dei quali tra cellule staminali neurali e cellule endoteliali, quelle che costituiscono i vasi sanguigni di una determinata zona dell’encefalo.

La comune credenza fino a 10 anni fa era che le cellule nervose nel cervello adulto non si dividessero più. Solo successivamente è stato dimostrato che nel sistema nervoso dell’animale adulto ci sono cellule staminali (Neural Stem Cells) che si dividono e differenziano a neuroni, ad astrociti ed ad oligodendrociti. In ogni caso il tessuto nervoso rimane un tipo di tessuto a basso turn-over cellulare.

 

Esistono malattie come il morbo di Parkinson e il morbo di Alzheimer che non sono a tutt’oggi efficacemente curate con la terapia farmacologica. Il morbo di Parkinson ha come patogenesi la degenerazione specifica di alcuni neuroni dopaminergici della sostana nera di Sommerfield, l’organismo si ritrova privo di dopamina, e nel paziente si producono sintomi come tremore, difficoltà nel movimento, perdita progressiva delle capacità cognitive e, infine, morte. I pazienti affetti dal Parkinson vengono curati con una terapia sostitutiva, con un farmaco sintetico che “mima” la dopamina, che è la Levodopa, ma che dopo un certo numero di anni comincia a perdere la sua efficacia. La terapia rigenerativa in questi casi, potrebbe costituire la svolta: il trapianto di cellule staminali neuronali potrebbe correggere il difetto e ricostruire la funzione in modo permanente, sono stati fatti infatti vari studi, vari esperimenti nei quali sono stati trapiantati neuroni su pazienti con morbo di Parkinson.
Da una immagine di PET presente sulle diapositive si può notare che le aree rosse (indicano attività) si sono notevolmente ampliate. Il trapianto di cellule derivate da embrioni ha avuto successo: le cellule hanno colonizzato la sostanza nera, si sono differenziate a neuroni dopaminergici, hanno cominciato a produrre dopamina, e hanno dato miglioramento notevole ai sintomi del paziente. Quello che si sta cercando di fare ora è superare i problemi etici: per trapiantare una persona, sono stati necessari circa dieci feti (abortiti spontaneamente o morti per cause naturali) al fine di ottenere un numero sufficiente di cellule.
Adesso si sta cercando di ottenere, attraverso il differenziamento delle cellule staminali embrionali, che si possono differenziare anche a neuroni, una sufficiente quantità di cellule per questo tipo di terapia.

 

Le cellule staminali epiteliali sono disseminate nello strato basale dell’epidermide. Esse formano l’unità proliferativa dell’epidermide (Epidermal proliferative Unit), composta da una cellula staminale circondata da almeno dieci cellule basali che compensano l’esfoliazione della colonna cellulare superiore. Questa teoria tuttavia non è un paradigma della nicchia staminale epidermica, in quanto questa struttura non è universale in ogni epitelio.
Già prima che si scoprissero le cellule staminali, i lembi di pelle venivano utilizzati per curare i grandi ustionati, con notevoli successi, da quando si è scoperta la cellula staminale epiteliale, questa applicazione di medicina rigenerativa è arrivata ai suoi massimi livelli poiché si è visto che da un piccolo lembo di pelle sana, si possono ricavare molti centimetri quadrati di tessuto epiteliale, coltivato in vitro.
I grandi ustionati sono esposti a numerosi rischi, sia dovuti a fenomeni tossici (sostanze tossiche inalate o assorbite che vanno a danneggiare il rene), sia a fenomeni infettivi. Si effettuano tante biopsie (il più possibile) sulle porzioni di pelle ancora sane del paziente, si mettono in coltura e nel giro di un paio di settimane (durante le quali il paziente dovrà rimanere in camera sterile) crescono, successivamente possono essere applicati direttamente sul derma, sul quale fanno presa senza dar luogo a fenomeni di rigetto in quanto derivanti dalla stessa pelle del paziente. Proprio a Modena, è stato effettuato un trapianto di lembi epiteliali, derivanti da cellule corrette con la terapia genica, in questo caso non si trattava di un paziente ustionato ma affetto da una malattia genetica causata dalla deficienza della laminina 5, che determina uno sfaldamento della pelle.
A questo paziente sono state prelevate le cellule staminali epiteliali, il loro genoma è stato corretto mediante un vettore virale (è stato inserito il gene che esprimeva la laminina 5); i foglietti epiteliali sono stati fatti crescere in terreno di coltura e, con tantissimi trapianti successivi si è ricoperto interamente il paziente con il tessuto epiteliale modificato. I trapianti di cornea da donatori, venivano praticati già da tantissimi anni, ma questa procedura ha avuto un notevole incremento quando si sono scoperte le cellule staminali della cornea: sono state saggiate diverse porzioni della cornea e si è visto che le cellule staminali sono collocate nella zona colorata di rosso che è il limbo.
Coltivando in vitro queste cellule, si è ora in grado di produrre dei lembi corneali che possono essere trapiantati su pazienti con notevole vantaggio rispetto ai normali trapianti: non si presentano infatti fenomeni di rigetto e tutti i problemi connessi alla ricerca di un donatore compatibile.

 

Per quanto riguarda le cellule staminali ematopoietiche, esse hanno avuto un notevole successo negli ultimi anni, soprattutto a Modena dove si fece il primo trapianto in Italia di midollo osseo. Le proprietà della cellula staminale emopoietica fanno riferimento al fatto che deve essere in grado di sostenere l’emopoiesi durante l’intero arco della vita, deve infatti avere la capacita’ di self-renewal, ovvero la capacità di generare altre cellule uguali a se stessa, in modo da mantenere un pool costante di cellule staminali nel midollo osseo, inoltre deve avere la capacità di dare origine a progenitori multipotenti, cioè dotati di una minore capacità proliferativa ma ancora in grado di dare origine a tutte le linee emopoietiche. I progenitori multipotenti generano poi i progenitori committed, cioè orientati verso una particolare linea differenziativa.

Esistono tre diverse sorgenti tissutali di cellule staminali ematopoietiche, ovvero il midollo osseo, il sangue periferico ed il sangue di cordone ombelicale. In condizioni fisiologiche esse sono presenti anche nel sangue periferico, ma con una bassissima frequenza, rappresentano infatti solo lo 0,06 % delle cellule mononucleate del sangue periferico. Per ottenere un numero sufficiente di cellule staminali ematopoietiche per il trapianto, vengono mobilizzate a livello del midollo rosso mediante la somministrazione di G-CSF (Granulocyte Colony Stimulating Factor) e raccolte mediante aferesi. Per quanto riguarda le applicazioni cliniche delle cellule staminali ematopoietiche, esse vengono utilizzate nella cura di leucemie e di linfomi, infatti in queste patologie neoplastiche del sangue, il paziente viene sottoposto a radio/chemioterapia che distrugge tutte le cellule ematopoieiche, comprese ovviamente quelle tumorali (mieloablazione). Successivamente, il paziente viene trapiantato con cellule staminali ematopoietiche provenienti da un donatore sano istocompatibile.

Vengono utilizzate anche nella cura di disordini emopoietici ereditari, quali diversi tipi di anemia e disordini metabolici. I disordini emopoietici includono l’anemia aplastica, la β-talassemia o l’anemia mediterranea, l’anemia falciforme e la SCID (Severe Combined Immunodeficiency). I disordini metabolici ereditari che vengono trattati con trapianto di HSC includono la sindrome di Hunter, la sindrome di Hurley, la sindrome di Lesh-Nyhan e l’osteopetrosi. Queste cellule vengono anche utilizzate nella terapia adiuvante la chemioterapia del cancro. L’autotrapianto di HSC viene utilizzato come terapia adiuvante durante il trattamento con chemioterapici di cancri non emopoietici, per la cui cura è necessario somministrare farmaci che bersagliano le cellule con maggiore attività proliferativa, i quali distruggono le cellule cancerose, ma anche le cellule del sangue. Quindi, prima della chemioterapia antitumorale, il paziente viene trattato con G-CSF per mobilizzare le proprie HSC nel sangue periferico, le quali possono quindi essere raccolte tramite aferesi e congelate. Una volta subita la chemioterapia intensiva, il paziente può ricevere il trapianto delle sue HSC precedentemente preparate, che ovviamente non causeranno fenomeni di rigetto.

 

Viene definito homing il processo di posizionamento nel midollo rosso delle cellule staminali ematopoietiche, mentre l’engrafment rappresenta la fase di ripopolamento midollare delle HSC. Questi sono processi multifasici che seguono la seguente cronologia, innanzitutto si ha un’interazione delle cellule staminali trapiantate con le cellule endoteliali dei capillari del midollo osseo. Viene operata mediante l’interazione tra P ed E-selectine sulle cellule endoteliali e i loro ligandi espressi sulla superficie delle cellule staminali emopoietiche, segue il rotolamento (“rolling”) delle HSC sull’endotelio e l’adesione stabile alla parete dei vasi mediante il legame di VLA-4 e LFA-1 sulle cellule staminali rispettivamente con VCAM e ICAM sulle cellule endoteliali, l’adesione alla parete dei vasi viene consolidata. L’espressione di queste molecole di adesione sulla superficie delle HSC è indotta dalla stimolazione operata dallo Stromal Derived Factor-1 (SDF-1), che è espresso dalle cellule endoteliali e che si lega a CXCR4 presente sulle cellule staminali emopoietiche. Si ha poi la fuoriuscita dai capillari midollari, le cellule staminali infatti escono dai capillari midollari e, muovendosi mediante l’adesione alla fibronectina mediata da VLA4 e 5, si dirigono verso le cellule stromali del midollo seguendo il gradiente di SDF-1 da esse prodotto. Infine abbiamo l’interazione con le cellule stromali midollari, che avviene tramite l’interazione tra VLA4 e VLA5 sulle cellule staminali con VCAM e ICAM sulle cellule stromali.

 

La cellula staminale ha un ruolo critico non solo nella generazione di un organismo pluricellulare, ma anche nello sviluppo dei tumori. Le cellule staminali tumorali derivano per mutazione dalle cellule staminali o dai progenitori normali, e successivamente proliferano e differenziano per creare il tumore. Così come le cellule staminali normali, le cellule staminali tumorali possono autorinnovarsi, dare origine ad una popolazione eterogenea di cellule figlie e proliferare estensivamente.

 

Allo stadio di preimpianto, che nell’uomo è rappresentato da 5 giorni dopo la fecondazione, la blastocisti contiene circa 100 cellule, suddivise in 2 tipi, ovvero in cellule del trofoblasto, che daranno origine agli annessi embrionali, e cellule della massa interna (Inner Cell Mass o ICM), che daranno origine all’embrione. Se rimuoviamo le ICM dalla blastocisti, non daranno più origine ad un embrione, ma se coltivate in vitro a linee chiamate ES cells. Le cellule staminali embrionali sono capaci di autorinnovamento e sono cellule pluripotenti, cioè possono dare origine alle cellule derivate da tutti e 3 i foglietti embrionali. Queste cellule proliferano estesamente nell’embrione, hanno la capacità di differenziare in tutti i tipi cellulari che si ritrovano nell’organismo adulto, e possono essere coltivate in vitro mostrando ancora la potenzialità di autorinnovarsi e generare tutti i tipi cellulari maturi. Le evidenze sono a favore dell’applicazione di questa tecnologia anche nell’uomo rispetto all’utilizzo di cellule staminali dell’adulto (vedi trapianto di cellule staminali neurali), anche se sussistono alcuni problemi, infatti esistono problemi etici dell’ottenimento delle ES cells e problemi di rigetto del trapianto, anche se questo problema è stato affrontato tramite la stabilizzazione di circa 1000 linee di ES cells, che sono state tipizzate e sono disponibili per il trapianto. Il potenziale rigetto immunologico delle ES cells può essere evitato in 2 modi, ovvero ingegnerizzando le ES cells con metodiche di terapia genica in modo che esprimano gli antigeni MHC del ricevente, oppure utilizzando il clonaggio terapeutico mediante l’uso della tecnica del trasferimento nucleare.

 

Nonostante tutto, la tecnica più promettente, che risolverebbe il problema del rigetto, è quella del clonaggio terapeutico, o therapeutical cloning, che prevede il prelievo di un nucleo da una cellula somatica del paziente, la sua riprogrammazione all’interno di un oocita anucleato e l’ottenimento di ES cells da differenziare in vitro e in seguito ritrapiantare nel paziente. L’oocita non fertilizzato possiede nel citoplasma alcuni fattori che normalmente riprogrammano il nucleo dello spermatozoo in modo da dare poi origine all’embrione. La clonazione si basa dunque su questa metodica, infatti previa rimozione del nucleo dell’oocita, il suo citoplasma può riprogrammare un nucleo proveniente da una cellula somatica di un organismo adulto (nuclear transfer) e dare origine ad un embrione, in questo senso la clonazione terapeutica ha lo scopo di produrre un embrione clonato dal paziente, e quindi di produrre ES cells a scopo transplantologico.

La clonazione terapeutica presenta però anche dei problemi tecnici sull’uomo, infatti noi uomini non siamo nè scimmie, nè pecore e nè topi. Innazitutto si parla di problemi legati all’aneuploidia, in quanto nei primati, al contrario di ciò che avviene in pecore, vitelli e topi, il processo di rimozione del nucleo dell’oocita causa la perdita di alcune proteine associate ai centrosomi. Sebbene l’iniezione del nucleo di cellula somatica faccia iniziare la mitosi, la formazione del fuso mitotico risulta alterata, e le cellule risultanti non riescono a segregare correttamente i cromosomi. Inoltre una mutazione somatica già presente prima del nuclear transfer può costituire un pericolo quando il clone di ES cells viene amplificato e reimpiantato nel paziente. Abbiamo anche un accorciamento precoce dei telomeri, la pecora Dolly infatti alla nascita aveva i telomeri lunghi come una pecora di 1 anno (80% della lunghezza normale), infine c’è il problema che coinvolge la metilazione del DNA nell’uomo, in quanto l’attivazione genica post-fecondazione avviene prima durante lo sviluppo embrionale (nello stadio a 4 cellule) rispetto al vitello o alla pecora (nello stadio a 8 cellule). Probabilmente non c’è abbastanza tempo per il DNA di una cellula umana adulta per riprogrammarsi poiché il suo genoma è già stato espresso e presenta anche un diverso stato di metilazione.

La pecora dolly è stata creata attraverso un’enucleazione di un oocita pecora (Scottish Blackface ewes) dopo trattamento con GnRH (gonadotropin Releasing Hormone). Come in tutti i mammiferi, l’oocita è arrestato in metafase della II divisione meiotica. In seguito è avvenuta la fusione dell’oocita enucleato con una cellula di ghiandola mammaria (pecora Finn Dorset ewe) resa quiesciente in coltura mediante starvation. La fusione avviene con l’applicazione di un impulso elettrico durante la co-cultura dell’oocita enucleato e della cellusa somatica. Oltre a provocare la fusione cellulare, l’impulso elettrico provoca anche l’attivazione della mitosi poiché mima la fecondazione. Dunque l’ovulo è stato coltivato in vitro fino allo stadio di morula o blastocisti (circa 6 giorni), poi abbiamo avuto il trasferimento di una madre surrogata Scottish Blackface ewes previamente trattata con GnRH, e la nascita di Dolly dopo 148 giorni.