Applicazione delle cellule staminali

Il vantaggio delle cellule staminali è che sono totipotenti, quindi se trovo le condizioni giuste posso fare differenziare queste cellule come voglio, hanno un genoma molto disponibile, molto plastico, per cui io posso ottenere certamente delle cellule neuronali, posso ottenere dal mesoderma delle cellule muscolari o delle cellule pancreatiche, oppure dall’endoderma il tessuto pancreatico. I tentativi in corso ora sono proprio questi, si cerca dalle cellule staminali embrionali di ricostruire dei tessuti in vitro, poi i tessuti ricostruiti possono poi essere impiantati. Ciò tenderebbe a sostituire il trapianto degli organi, ad esempio un diabetico grave che non produce più insulina, se io riesco a ricostruire le isole pancreatiche è un vantaggio, e non è detto che io debba mettere queste cellule nel pancreas, le posso far sopravvivere sottocute, basta che producano insulina. Non c’è bisogno di ricostruire perfettamente la situazione, basta che queste cellule funzionino, per le ghiandole endocrine questo è fondamentale, ma anche per tutti gli altri tipi di cellule comprese le cellule germinali. L’idea è proprio questa, dalla totipotenza cerco di ricostruire i miei tessuti, ovviamente siamo ben lontani da questo e neanche nel topo si è riusciti a ricostruire dei tessuti di topo da impiantare nel topo. Ci sono dei problemi perché le condizioni sperimentali che uso per differenziare le cellule non sono perfette, sembrano ricette, ma non è detto che siano perfettamente funzionanti. Ciò apre un problema di business, ad esempio quante “company” si potrebbero formare al fine di ricostruire dei tessuti? Già ci sono, e l’idea è sempre quella, ovvero di mettere le cellule in coltura, farle differenziare e ottenere un tessuto in coltura da impiantare.

In microscopia le cellule staminali embrionali sono praticamente tutte formate dal nucleo, c’è pochissimo citoplasma. Il nucleo ha quasi tutta una cromatina rilassata, è un genoma molto predisposto ad essere trascritto nelle varie regioni, di fatto se deve dare tessuti di diversa origine non c’è un controllo così stretto sulla trascrizione.

La “cell therapy” è dunque questo concetto, vuol dire utillizzare le cellule staminali al fine di riprodurre in termini di colture cellulari dei tessuti adeguati per l’impianto. Già ci sono dei successi notevoli per la ricostruzione delle isole pancreatiche e sul midollo osseo, però per quanto riguarda il midollo non si conoscono i meccanismi di “self-renewal” delle cellule staminali emopoietiche.

In vitro potrei ottenere tutti i tessuti, per mantenere le cellule staminali embrionali come tali ho bisogno però dell’espressione di questo fattore trascrizionale, che è un gene OCT, in particolare i geni OCT3/4 devono essere espressi, in più bisogna trattare con il LIF, che è un inibitore del differenziamento, queste cellule staminali embrionali. In questo caso le cellule fanno self-renewal e riesco ad ottenere una linea cellulare stabile da cellule embrionali anche umane.

Quindi le cellule staminali embrionali sicuramente sono un potenziale di studio incredibile, in Italia non possiamo studiarle e nonostante che ci siano tanti embrioni fecondati in azoto liquido, che dopo alcuni anni nessuno tenta più di impiantare, la normativa non prevede che si possano usare a scopo di studio. Non vengono usate per procreare e probabilmente fra qualche anno questi embrioni congelati verranno eliminati. Il problema è serio e dal punto di vista etico è una situazione delicata. C’è una lotta che i ricercatori fanno per poterli utilizzare a fini di studio, ciò non è irrilevante in termini di politica della ricerca perché altre nazioni lo fanno già, quindi se alla fine qualcuno ottiene dei grossi risultati è evidente che noi ne siamo esclusi completamente.

Noi però possiamo lavorare sulle CELLULE STAMINALI DELL’ADULTO. Esse sono un po’ in tutti i tessuti, si riteneva che il cervello fosse un organo permanente che non si ricambiasse minimamente, in realtà ci sono anche le cellule staminali embrionali che danno origine a vari tipi di neuroni in vitro, e quello che si cerca di fare anche se non c’è nulla di concreto, è quello di vedere se nelle zone degenerate queste cellule sono in grado di essere richiamate sulle zone lesionate, e se sono in grado di ricostruire il tessuto lesionato. Bisogna fare differenza tra la MEDICINA RIGENERATIVA che si occupa di rigenerare un tessuto, una struttura di un tessuto, e la MEDICINA RIPARATIVA che prevede che le cellule staminali possano andare nella zona di lesione ma, invece che ricostruire un tessuto neuronale producono dei fattori che contribuiscono al riparo del danno non con tessuto fibroso ma in altro modo, in questo caso dunque non si ricostruisce la struttura di un tessuto, ma si ripara in un modo diverso.

Questo esempio è applicato a tutte quelle terapie che si fanno sul cuore, in particolare di inoculo delle cellule staminali nelle zone infartuate per vedere se si rigenera il tessuto muscolare cardiaco, ma nessuno c’è riuscito fino ad oggi, però la situazione migliora probabilmente per una neoangiogenesi, e in questo caso non si ripara con tessuto fibroso semplicemente, ma succede qualcosa di diverso che aumenta comunque la funzionalità cardiaca. Questi esperimenti da quest’anno proprio perché non hanno un razionale scientifico provato sono stati sospesi. La cosa più semplice che si faceva con il “trial” nell’infarto era quello di prendere le cellule mononucleate del sangue periferico e con un aghetto iniettarle nella zona infartuata. E’ un’utopia pensare che cellule staminali del sangue facciano facilmente dei cardiomiociti, però qualcosa di importante in termini di neoangiogenesi e ricostruzione dei circoli vasali collaterali succedeva. Questo ripropone in termini consistenti che bisogna continuare a fare ricerca, in ogni caso la stessa cosa è stata osservata per le cellule staminali neuronali, in particolare è stato utilizzato il tentativo di iniettarle nel liquor di topolini per andare a colonizzare le zone cerebrali, e non solo per le lesioni cerebrali ma anche per la ricostruzione del midollo spinale, perché in caso di lesioni del midollo spinale con paralisi si cerca di ricostruire e di ricollegare i tratti del midollo spinale che sono stati lesionati, non c’è però ancora niente di risolutivo nel’uomo. Sono da citare patologie gravi come il morbo di Parkinson, in cui la situazione migliora un po’ se trapianto nei pazienti dei tessuti fetali neuronali dove ci sono arricchimenti di cellule staminali, però anche qui i risultati non sono definitivi.

Molto più consistenti sono i risultati di applicazione delle cellule staminali dell’epidermide, perché queste cellule staminali di fatto unipotenti in realtà si possono mantenere bene in coltura, e se faccio un saggio clonale distinguo tre tipi di comportamento di queste cellule, in particolare distinguo gli OLOCLONI, le vere cellule staminali che fanno self-renewal, i MEROCLONI, che sono i precursori che hanno una limitata capacità di proliferare perché poi vanno in differenziamento e crescono meno degli olocloni, infine abbiamo i PARACLONI che sono le cellule differenziate che in un saggio clonogenico non crescono più. Se prendo queste cellule e le tengo in coltura riesco a ricostruire un intero lembo di epidermide in laboratorio. Ciò è importante perché già da diversi anni le applicazioni prevedono la ricostruzione di epidermide in laboratorio per i grandi ustionati, posso costruire lembi di epidermide da impiantare sulle zone ustionate facendo migliorare nettamente la situazione. Ciò è fatto in alcuni centri, anche a Modena dove è appena stato costruito un grosso centro di medicina rigenerativa grazie al reclutamento di ricercatori che nel settore sono il top, ovvero Michele De Luca, Graziella Pellegrini e Fulvio Maniglio.

La stessa cosa succede per la cornea, l’epitelio corneale è infatti un epitelio multistratificato con caratteristiche peculiari, è un epitelio trasparente perché non è vascolarizzato in cui le cellule staminali si trovano nel limbus, quel cerchietto intorno alla pupilla colorato. Anche qui c’è la stessa situazione, ovvero troviamo degli olocloni, dei merocloni e dei paracloni. Le lesioni corneali come l’opacamento sono situazioni molto frequenti (ad esempio per la casalinga che usa acidi e detersivi e poi si strofina gli occhi), in questi casi si perde la trasparenza e la capacità di vedere. I trapianti di cornea da cadaveri erano già una cosa fatta da tempo, però in questo caso si riesce a ricostruire la cornea con le cellule staminali dell’individuo, non devo più tenere il paziente sotto immunosoppressione per evitare il rigetto, anche se il tessuto è poco vascolarizzato. Anche un opacamento corneale totale può essere risolto, si scolla l’epitelio, ricostruito in laboratorio usando le cellule staminali del paziente, poi si può impiantare perché cresce su uno strato di fibrille, si dà qualche punto di sutura, la fibrina si riassorbe e l’epitelio si riattacca. Ci sono inoltre dei tentativi biotecnologici per ricostruire tutto il bulbo oculare, quindi non solo un epitelio di superficie ma anche tutte le membrane che ci sono nell’epitelio corneale con materiali resistenti biocompatibili, ciò però non è ancora fattibile.

Se considero una cellula staminale emopoietica multipotente, per ottenerla posso fare delle biopsie nell’area iliaca, ricca di midollo osseo, anche nei trapianti di midollo osseo infatti ai donatori il prelievo viene fatto dalla cresta iliaca. Le cellule staminali emopoietiche sono anche circolanti per cui si possono prelevare anche per leucoaferesi, cioè dal sangue periferico recupero tutte le cellule CD34 positive. Recentemente vengono anche prelevate dal sangue di cordone ombelicale, a Modena ad esempio c’è una banca di cellule staminali provenienti dal cordone ombelicale, però deve avere un numero minimo di cellule per essere mantenuto dalla banca, circa 5 milioni di cellule staminali, in quanto una quantità inferiore non è utile a fini trapiantologici. I comitati etici hanno accettato ciò perchè anche il cordone ombelicale è una fonte notevole di cellule staminali che si possono separare, studiare e far differenziare in vitro.

Per quanto riguarda la TERAPIA GENICA, non si usano cellule staminali embrionali derivate dalla fecondazione, ma si prendono ad esempio cellule dalla cute e si fanno crescere, poi si prende un oocita, si toglie il nucleo, si inserisce il nucleo della cellula somatica, si dà una piccola scarica elettrica e parte il “development”. Si arriva poi alla blastocisti e si prendono le cellule staminali embrionali, questa è la tecnica con cui è stata fatta la pecora Dolly. Questa è una cosa eticamente accettabile? Ho fatto una manipolazione cellulare, così ottengo cellule staminali embrionali identiche a quelle che avrei ottenuto con la fecondazione, ma di fatto noi non possiamo lavorare neanche con questa metodologia. Ciò che ci ha insegnato la pecora Dolly è molto importante, essa infatti è nata con grossi problemi, ovviamente il nucleo di una cellula somatica e il DNA nel tempo subisce dei danni, ma quando si impianta un nucleo nell’oocita i danni al DNA rimangono quelli e la pecora Dolly è nata dell’età della madre perché aveva un invecchiamento del suo DNA, era piena di reumatismi, di malattie ed è morta giovane.

In un tentativo di studio fatto a Modena, il problema era la laminina 5, quindi il collegamento della placca d’adesione dell’epidermide con il sottocutaneo non avveniva più, per cui il paziente era pieno di bolle, aveva l’EPIDERMOLISI BOLLOSA. Nelle cellule staminali dell’epidermide è stato inserito il gene giusto con un vettore retrovirale e questo ha permesso alla cute di aderire. E’ da due anni che è stato fatto l’impianto e la cute è stabilmente collegata, ciò vuol dire che visto che noi cambiamo la cute ogni 21 giorni, l’epidermide riceve cellule staminali giuste che continuano a ricambiare il tessuto e quindi è stato corretto un difetto genetico.