Apoptosi e Necrosi cellulare

Fino alla fine degli anni Ottanta si credeva che la cellula fosse un’entità immortale, generata nell’embrione e con una vita illimitata fino alla morte dell’organismo.
Si era notato che le cellule potevano morire, ed era stata descritta una modalità di morte che era la necrosi, in seguito a “incidenti”, ovvero la necrosi avveniva quando il tessuto o il gruppo cellulare era sottoposto a stimoli come ipossia (scarsa ossigenazione), ischemia (scarsa irrorazione da parte del circuito sanguigno), ipertermia (aumentata temperatura del tessuto) o trattamento con particolari veleni. Quindi si pensava che la necrosi fosse l’unica modalità di morte, cioè una morte accidentale della cellula che avveniva solamente quando nell’ambiente si creavano situazioni particolarmente sfavorevoli, non si credeva che la morte della cellula potesse anche essere un evento fisiologico.

Poi si notò che cellule coltivate in vitro morivano manifestando anche segni diversi dalla necrosi, cioè con modalità e con caratteristiche biochimiche e morfologiche diverse da quelle che caratterizzano la necrosi, quindi si iniziò a postulare che esistesse una modalità di morte diversa.

Così si insinuò il concetto che le cellule non erano immortali e che in qualche momento della loro vita fossero indotte alla senescenza e poi morissero in modo fisiologico, senza l’intervento di nessun incidente, questa teoria oggi è universalmente accettata. Fu stabilito che la morte cellulare fisiologica che segue all’invecchiamento cellulare è detta apoptosi. Il termine apoptosi, in greco, significa “caduta dei petali dei fiori”, questo per significare che la modalità di morte per apoptosi è un evento fisiologico così come sono fisiologici i fenomeni del mondo vegetale. Così si è incominciato a confrontare le caratteristiche morfologiche e biochimiche delle due modalità di morte, che sono molto diverse. L’apoptosi è una modalità di morte che fa fisicamente scomparire la cellula dal tessuto, senza provocare infiammazioni.

L’apoptosi rappresenta un meccanismo endogeno di suicidio cellulare, ben distinto dalla necrosi (che la cellula subisce, non attiva), che gioca un ruolo importante in una serie di processi biologici fondamentali, quali l’embriogenesi, dove devono essere distrutte delle strutture durante il rimodellamento tissutale, oppure nel rimodellamento tissutale e nella metamorfosi, ad esempio le pieghe interdigitali delle mani devono scomparire prima della nascita, o le metamorfosi (per le rane, ad esempio) da larva ad animale adulto. Nel turn-over cellulare l’apoptosi è molto importante perchè il ricambio cellulare in un tessuto è fondamentale, per sostituire quelle cellule che invecchiano. Nella selezione timica invece è un meccanismo importante durante la formazione dei linfociti T, in cui avviene una selezione negativa delle cellule (timociti) che non sono riusciti a riarrangiare in modo utile il gene per il recettore TCA, importantissimo per la loro funzione.


Questo perché, durante la maturazione del sistema immunitario, si possono formare delle cellule che sono attive contro il self, ovvero contro il nostro organismo, per errore, queste cellule devono essere prontamente eliminate per evitare la distruzione di strutture nell’organismo stesso. Infine nell’UCCISIONE DEL TARGET NELLE REAZIONI DI CITOTOSSICITÀ, ad esempio cellule infettate da virus e cellule tumorali: l’interazione delle cellule linfociti killer su cellule infettati da virus e cellule tumorali ha come conseguenza la produzione da parte del linfocita T di sostanze proapoptotiche che inducono   l’apoptosi nella cellula bersaglio. Nella maggior parte dei casi questo ha un’efficienza notevole, che però non è del 100 %. L’apoptosi è dunque una modalità di morte che fa fisicamente scomparire la cellula dal tessuto, senza provocare infiammazioni.

I segnali che influenzano l’attivazione dell’apoptosi sono le radiazioni ionizzanti, che danneggiano il DNA, le infezioni da virus, che commissionano la cellula ad esprimere determinati antigeni, e quindi la commissionano alla morte, fattori di crescita particolari e ormoni particolari, che interagiscono con particolari recettori chiamati recettori di morte presenti sulla cellula bersaglio ed interazioni recettoriali. La voce “fattori di crescita” racchiude l’intervento di fattori che possono indurre l’apoptosi, ma anche di fattori che normalmente regolano la sopravvivenza della cellula. Quindi la rimozione di fattori di crescita che aiutano la cellula a sopravvivere e a proliferare può essere una causa di apoptosi, così come l’azione di alcuni fattori (chiamati comunque fattori di crescita), che inducono invece solo la morte cellulare.

La cellula apoptotica passa attraverso una serie di stadi morfologicamente identificabili: nella fase iniziale dell’apoptosi una singola cellula perde i contatti con le altre cellule del tessuto, quindi il processo apoptotico insorge non in un gruppo di cellule, ma in una singola cellula, che deve essere condizionata alla morte. In questa cellula il nucleo si condensa (fenomeno che si chiama picnosi) e successivamente si frammenta (carioressi). Successivamente la cellula si contrae a causa della disidratazione citoplasmatica e della condensazione delle proteine, vengono attivati degli enzimi, tra cui la transglutaminasi, che condensano le proteine, contemporaneamente c’è una perdita d’acqua e quindi una contrazione, per cui la cellula diventa più piccola, più densa. La maggior parte degli organuli intracellulari rimane intatta (a differenza della necrosi), sebbene si verifichi la dilatazione del reticolo endoplasmatico e dei mitocondri. Nella fase successiva si hanno il “ruffling”, cioè l’increspatura e il “blebbing” ossia la formazione di estroflessioni, della membrana plasmatica, queste estroflessioni diventano sempre più grandi, man mano si staccano dalla cellula e portano alla frammentazione cellulare. Questi frammenti non contengono solamente citoplasma, ma anche porzioni di nucleo che si era precedentemente frammentato. I frammenti, o corpi apoptotici, che ne derivano, contengono anche porzioni di nucleo, sono gemmati dalla cellula e quindi sono sempre rivestiti da membrana. Infine, i macrofagi fagocitano i frammenti e li degradano completamente. Fanno quindi fisicamente scomparire la cellula, in poche ore.

Il processo apoptotico è molto rapido, infatti come detto le cellule che vanno incontro ad apoptosi possono scomparire entro poche ore dall’inizio del processo. L’apoptosi non porta la liberazione di prodotti cellulari all’esterno della cellula, perché tutti i corpi apoptotici sono sempre rivestiti da membrana, al contrario della necrosi che porta alla lisi della cellula, e quindi alla liberazione all’esterno dei componenti citoplasmatici e di conseguenza all’induzione di una risposta immunitaria, che è sempre dannosa per il tessuto. L’ apoptosi quindi non porta all’attivazione del sistema immunitario: questa è una cosa importantissima, perché se ogni volta che una cellula deve morire ci fosse una risposta immunitaria aspecifica, questo comporterebbe un grande spreco di energia.

Quindi la finalità del processo di apoptosi è quella di predisporre l’eliminazione della cellula in assenza di fuoriuscita di materiale potenzialmente pro-infiammatorio o immunostimolante, finalità perseguita in modo metabolicamente attivo. L’apoptosi dipende da un programma genetico, non è un fenomeno che la cellula subisce, ma è un meccanismo attivo, che la cellula induce dopo la ricezione di particolari stimoli. Si parla quindi di morte cellulare programmata (PCD, programmed cell death), perché è un evento che richiede l’innesco di un ben preciso programma genetico da parte della cellula. Addirittura la teoria che è oggi universalmente accettata è quella di un programma di morte sempre in esecuzione, ma contrastato da stimoli che promuovono la sopravvivenza. In particolare l’apoptosi si può verificare a seguito della perdita di segnali trofici (segnali di nutrimento, di sopravvivenza, dati dai fattori di crescita, come l’EGF (fattore di crescita epiteliale) o le citochine emopoietiche). Quindi numerosi fattori di crescita, ormoni e altri fattori esterni prevengono l’ apoptosi, appunto perchè sono quei fattori che mantengono la cellula in uno stato proliferante di sopravvivenza.

L’apoptosi, come detto prima, a differenza della necrosi, è un processo attivo, quindi richiede energia metabolica, oltre alla sintesi di RNA, richiede anche la sintesi proteica, perché per avviare un processo genetico, ovviamente, serve attivazione della trascrizione e poi anche traduzione di proteine specifiche. Una cosa importante è che nell’apoptosi la frammentazione della cromatina nucleare si verifica a livello dei siti internucleosomici, ovvero a livello del DNA linker che collega un nucleosoma all’altro, mentre nella necrosi la frammentazione del DNA nucleare avviene in modo casuale, random, quindi in un nucleo apoptotico si formano frammenti di DNA di lunghezza pari a multipli interi di un nucleosoma, cioè 180 – 200 paia di basi. Il DNA linker, quindi, viene attaccato da parte di una specifica DNAsi detta CAD, caspase activated Dnase, cioè attivata dalle caspasi, che sono degli enzimi proteolitici che sono i protagonisti degli eventi apoptotici nella cellula.

I processi di proliferazione e l’apoptosi sono collegati: nei tessuti con alta capacità di ricambio (fegato, epiteli, midollo osseo) la proliferazione ha inizio da una popolazione di cellule staminali, infatti una frazione di queste cellule va incontro continuamente a differenziamento ma, dopo un periodo di vita limitato, vanno incontro ad apoptosi. Molti tessuti con capacità di ricambio possono rispondere allo stress fisiologico mediante un notevole aumento della proliferazione cellulare e quindi del numero di cellule, fenomeno che si chiama iperplasia. Questo fenomeno è il risultato di due componenti: una proliferativa, attivata da fattori di crescita come le citochine e gli ormoni, che stimolano la moltiplicazione delle cellule staminali (che quindi generano più cellule differenziate), e una di sopravvivenza attivata da fattori che sopprimono l’apoptosi delle cellule progenitrici. Ad esempio l’eritropoietina (EPO) che è un fattore antiapoptotico per gli eritroblasti, cioè per i globuli rossi che si stanno differenziando (ormone che funziona per regolare il differenziamento degli eritrociti), normalmente dà origine ad un certo numero di eritrociti e di conseguenza ad un certo livello di ematocrito (quello fisiologico).

Quindi se si stimola l’organismo farmacologicamente assumendo eritropoietina esogena, viene stimolata la proliferazione delle cellule staminali emopoietiche, che danno origine agli eritroblasti, e nel contempo viene soppressa l’apoptosi fisiologica di un certo numero di eritroblasti che durante il differenziamento vanno incontro ad apoptosi. Il risultato è un aumento degli eritrociti maturi, che danno quindi origine ad elevati livelli di ematocrito, che sono frequentemente rilevati negli sportivi (la assumono per avere più globuli rossi, quindi per poter svolgere un maggiore lavoro aerobico). Normalmente il livello di eritropoietina nel nostro organismo è importante per regolare la produzione dei nostri globuli rossi in relazione alle condizioni ambientali. Per esempio, in alta montagna, in cui la pressione parziale dell’ossigeno diminuisce, in un paio di giorni si ha l’acclimatamento, ovvero si ha l’aumento moderato dei globuli rossi grazie all’azione dell’eritropoietina (che è prodotta da alcune cellule del rene). Viceversa, quando si torna alle normali altitudini, l’eritropoietina prodotta diminuisce e tutto ritorna come prima. Quindi, fisiologicamente, si ha l’adattamento del numero di globuli rossi in adattamento all’ambiente.

Quindi l’omeostasi tissutale che è importantissima per l’organismo, rappresenta l’equilibrio che si crea tra produzione di nuove cellule ed eliminazione delle cellule vecchie, e questo è uno degli obiettivi principali di ogni organismo pluricellulare.

Riassumendo le principali caratteristiche dell’apoptosi riguardano la proprietà di possedere specifici markers morfologici e biochimici, è un processo regolato finemente da un programma genetico, è contraddistinto da un’attività trascrizionale e traduzionale, la frammentazione della cromatina nucleare anticipa la morte cellulare mentre la frammentazione del DNA con la condensazione della cromatina sono importanti markers del processo apoptotico.

Riassumiamo ora le principali differenze tra necrosi ed apoptosi: nella necrosi abbiamo la perdità dell’integrità della membrana plasmatica, un rigonfiamento cellulare con conseguente lisi e rilascio di materiale che causa una risposta infiammatoria, si ha la disintegrazione degli organelli e la flocculazione della cromatina, è un processo passivo non regolato geneticamente in cui il DNA si frammenta in maniera casuale, muoiono diversi gruppi cellulari e viene indotta da stimoli non fisiologici. A sua volta l’apoptosi è caratterizzata dal fatto che la membrana plasmatica forma i cosiddetti “blebs” ma rimane intatta, la condensazione cellulare avvine senza lisi, ovvero la scomparsa della cellula avviene senza infiammazione, mentre gli organelli rimangono intatti, a parte una modesta dilatazione dei mitocondri e del reticolo endoplasmatico. Avviene anche la condensazione della cromatina e l’aggregazione alla membrana nucleare, ovvero la marginazione della cromatina, si ha la formazione di vescicole rivestite da membrana, i cosiddetti corpi apoptotici, ed è un processo attivo. Si ha la frammentazione del DNA ai siti internucleosomici, è un processo regolato geneticamente ed avviene la morte di una singola cellula. È indotta da stimoli fisiologici e non provoca infiammazione.

Bisogna inoltre osservare che dal punto di vista cronologico il processo apoptotico può essere suddiviso in 2 fasi, ovvero l’induzione, che può essere anche reversibile, e l’esecuzione, che invece è irreversibile. Nella fase d’induzione la cellula riceve lo “stimolo” apoptotico (segnali extracellulari o segnali endogeni) per innescare i processi di morte cellulare. Perciò in base al rapporto tra fattori anti-apoptotici e pro-apoptotici la cellula sopravvive o passa alla fase di esecuzione. Quindi in base alla concentrazione di fattori proapoptotici e alla concentrazione di fattori di crescita che favoriscono la sopravvivenza, ma anche all’espressione di geni pro e anti apoptotici all’interno della cellula, la cellula sopravvive o no. La fase d’esecuzione (irreversibile) è invece determinata dall’attivazione di eventi a cascata proteolitici e nucleotidici (che distruggono sia le proteine che gli acidi nucleici) programmati, che amplificano il segnale e portano alle modificazioni morfologiche tipiche dell’apoptosi. Nello specifico questa fase è determinata dall’attivazione di particolari proteasi, dette caspasi (Cysteinyl aspartate-specific proteinases), che sono proteasi ricche in cisteina, che tagliano in corrispondenza dei residui di acido aspartico nelle proteine che devono degradare.

Quando la cellula riceve un insulto dall’esterno (una radiazione, un virus o un farmaco), cioè viene danneggiata, essa mette in atto tutti i sistemi che ha a disposizione per riparare il proprio DNA. Ma nonostante questo possono succedere due cose: i sistemi di riparo del DNA agiscono e sono in grado di riparare il danno al DNA, oppure tali sistemi non agiscono e la cellula innesca il processo apoptotico, cioè si “suicida” e si autoelimina. I geni che all’interno della cellula regolano la propensione di una cellula a morire e quelli che la proteggono sono, per esempio, i geni della famiglia Bcl2.

Infatti i membri di questa famiglia il cui capostipite è la Bcl2 codificano per una serie di proteine che dimerizzando possono formare omodimeri o eterodimeri, e a seconda di ciò ce si forma questi agiscono da promotori o da soppressori dell’apoptosi. Nello specifico i geni della famiglia Bcl2 sono tantissimi, infatti abbiamo gli OMODIMERI BAX-BAX, che sono proapoptotici, e gli ETERODIMERI BAX-BCL2, che sono antiapoptotici. Quindi, quando nella cellula abbiamo alte concentrazioni di Bax rispetto a Bcl2, verrà favorita la formazione degli omodimeri Bax – Bax, e quindi degli omodimeri proapoptotici, che fanno progredire la cellula verso il processo apoptotico. Viceversa, alte concentrazioni di Bcl2 portano alla formazione di eterodimeri Bax – Bcl2, che invece proteggono la cellula dall’apoptosi e promuovono la sopravvivenza. Quindi gli stimoli proapoptotici vanno su una “bilancia”, in cui se gli induttori di morte sono più espressi, determinano una promozione del segnale di morte da inviare alla cellula e quindi l’apoptosi, mentre se sono più espressi i geni antiapoptotici, questi determinano un blocco del segnale apoptotico che viene dall’esterno, quindi una reversione della fase di induzione e quindi la sopravvivenza. Si parla perciò di un bilancio di espressione.

La proteina P53, ha un ruolo importante nell’apoptosi, regola infatti i checkpoint cellulari ed induce la proteina P21 quando la cellula ha il DNA danneggiato per permetterle di ripararlo. Ma qual’ora il danno sia troppo grande, la cellula va in apoptosi per attivazione trascrizionale del gene proapoptotico Bax da parte di P53. Quindi se i sistemi di riparo non riescono a riparare il DNA adeguatamente, la p53 stessa (che è un fattore trascrizionale) va ad attivare trascrizionalmente l’espressione di Bax (va sul promotore di Bax, ne attiva l’espressione). Verranno quindi prodotti molti monomeri di Bax che andranno a formare omodimeri Bax – Bax, i quali a loro volta indurranno l’apoptosi per eliminare la cellula con un DNA mutato e danneggiato in modo irreversibile. Se invece P53 è mutata o inattivata, come in certe forme tumorali, la cellula va verso l’instabilità genica e quindi verso la trasformazione tumorale. Quindi l’P53 è uno dei principali bersagli della trasformazione tumorale, difatti è mutata in circa il 60% dei tumori umani.

Tornando all’induzione dell’apoptosi esistono due vie: la via estrinseca e la via intrinseca. La cellula in ogni caso riceve sempre lo stimolo, da proteine adattatrici, che vengono attivate delle caspasi iniziatrici che a cascata attivano caspasi effettrici che alla fine causano gli eventi morfologici evidenziabili dell’apoptosi, come la frammentazione del DNA. Quindi le caspasi sono degli enzimi che inizialmente nella cellula sono in forma inattiva, poi vengono attivate solamente quando il segnale apoptotico viene promosso e la fase esecutiva si compie.

La via estrinseca  comincia con l’interazione di una proteina proapoptotica, come FAS – LIGAND, col suo recettore, che è un cosiddetto recettore di morte, che trimerizza e che, una volta che il ligando è attaccato alla sua porzione extracellulare, recluta sulla sua porzione intracitoplasmatica la procaspasi 8, che è una molecola più lunga della caspasi attiva, e che viene attivata con una modificazione post-traduzionale che è il clivaggio proteolitico. Quindi il clivaggio proteolitico della procaspasi 8 porta all’attivazione della caspasi 8, che è più corta, e all’attivazione a cascata di altre caspasi (come la 3, la 6, la 7). A questo punto le caspasi attive, e in particolare la caspasi 3, arriva nel nucleo e va ad attivare quella DNAsi che si chiama CAD, che taglia a livello internucleosomico la cromatina. A questo punto la morte ormai è irreversibile.

La via intrinseca, invece, parte dall’interno della cellula, e più esattamente dal mitocondrio. Qui entrano in gioco le proteine della famiglia di BCL2, cioè BAX e BCL2, difatti quando l’equilibrio tra BAX e BCL2 è a favore di BAX, si formano degli omodimeri BAX-BAX, che sono proapoptotici, cioè si vanno ad inserire nella membrana esterna mitocondriale, causando un’entrata di acqua (formano dei pori nella membrana mitocondriale esterna causando l’entrata di acqua nel mitocondrio, e quindi il suo rigonfiamento). Poi il rigonfiamento del mitocondrio causa la rottura delle creste mitocondriali ed il relativo rilascio di proteine come citocromo C e altre molecole, che formano un complesso che si chiama apoptosoma, il quale va ad attivare un’ altra caspasi iniziatrice, che nella via intrinseca è la caspasi 9. Tale caspasi poi converge sull’attivazione delle caspasi 3, 6 e 7, e quindi le due vie si ricongiungono a livello dell’attivazione della caspasi 3, a cui segue l’attivazione di CAD e la seguente frammentazione del DNA nucleare.

In particolare gli stimoli che attivano la via intrinseca sono il danno al DNA, lo stress ossidativo da radicali liberi dell’ossigeno e la mancanza di fattori di crescita. Questi fattori fanno infatti aumentare BAX, andando così ad attivare la via intrinseca, che viene attivata anche dalla P53.

Un altra rappresentazione della via intrinseca prende in considerazione BAX che viene localizzato dal citoplasma alla membrana mitocondriale esterna, dove interagisce con la cardiolipina e forma dei pori transmembrana, la cui apertura provoca la cosiddetta MMP (Mitochondrial Membrane Permeabilization) e il conseguente abbassamento del potenziale di membrana mitocondriale. Tutto ciò consente l’entrata di soluti e di acqua, che provocano la distensione delle creste, la rottura della membrana mitocondriale esterna e il rilascio di fattori pro-apoptotici (AIF , Cyt C e APAF-1). Poi Cyt C e APAF-1 attivano la Caspasi 9, che a sua volta attiva la Caspasi 3, con conseguente attivazione di DNAsi e la frammentazione del DNA.

Si è infine osservato che i recettori di morte a livello citoplasmatico contengono un death domain, cioè una regione di morte, che recluta FADD, che è un’altra proteina (Fas-Associated Death Domain) e la procaspasi 8. In questo caso l’apoptosi, che è mediata dall’interazione del ligando con il recettore di morte (in particolare del recettore FAS con suo ligando FAS-L), è particolarmente importante nella selezione periferica dei linfociti B e T autoreattivi (linfociti che riarrangiano varie regioni in modo erroneo e quindi sono reattivi verso il self, verso l’organismo stesso, devono essere eliminati inducendo apoptosi tramite il sistema della via estrinseca).